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    高通量测序后的实验验证手段——转录组篇(上)

    对于高通量技术大家一定都不陌生,但生物信息分析之后该做什么呢?本文和大家探讨并分享高通量测序后的实验验证,即该用什么技术做什么验证!

    先和大家探讨最常见的转录组测序后的验证方法。转录组的验证方法有点多(如表达量验证、亚细胞定位、RNA结合蛋白、功能获得验证、功能缺失验证等),本篇只先介绍表达量验证、RNA结合蛋白、亚细胞定位,其余的下期见!

    表达量验证

    一般情况我们优先选择高表达量的RNA,以及差异表达明显的RNA去验证。去验证某个基因或者RNA的表达量时,需要保证没有基因组DNA的污染。PS:如果是非编码RNA验证,由于他们可能不含polyA尾巴,所以要注意反转录方式。

    qRT-PCR

    设计引物RNA进行qRT-PCR。

    哈哈哈,如果你和小编一样曾是生信dog,我相信你一定一脸懵逼,我连PCR到底是啥能干啥都不知道,你跟我说qRT-PCR!

    小编以一个实验编外人士跟你通俗易懂的科普一下,PCR是设计引物判断某个DNA序列是否存在的技术;RT-PCR对RNA进行反转录(Reverse transcription)得到cDNA后,以cDNA为模板进行PCR反应,进而判断某个RNA序列是否存在的技术;qPCR不只判断DNA是否存在,还能判断含量高低,qRT-PCR即quatitative RT-PCR,是判断RNA是否存在以及含量高低的技术!

    总结一句话,PCR都得设计引物,带RT就是研究RNA,不带RT就是研究DNA,带q就是定量,不带q就是定性!至于他是咋定量的呢,划重点,靠内参!!

    Northern blot

    Northern blot 首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分,然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。PS:?Northern blot样品需除去RNA酶。

    小编再给大家科普一下下,Western Blot做蛋白,Southern Blot做DNA,Eastern blotting是Western Blot的变?#25105;?#26159;作蛋白,不过没得到广泛认可。

    灵敏度:qRT-PCR?>?Northern blot

    特异性:Northern blot?>?qRT-PCR

    RNA和蛋白互作验证

    RNA结合蛋白(RNA Binding Protein)是一类伴随RNA的调控代?#36824;?#31243;,与RNA结合的蛋白质的总称。RBP伴随RNA生命始终,其主要作用是介导RNA的成熟、转运、定位和翻译;一个RBP可能存在多种靶标RNA;且其表达缺陷会造成多种疾病。RNA与蛋白相互作用是RNA功能研究的焦点问题之一。

    RNA-pull down

    已知RNA,寻?#21307;?#21512;蛋白。

    RNA pull-down实验就是先将RNA进行标记(如生物素探针标记)再与蛋白共同孵育,从而形成RNA-蛋白质复合物,通过SDS-PAGE分离蛋白质,最后通过WB(western blot)或质谱(mass Spectrometry)检测蛋白质。

    该技术用于寻找与目的RNA结合的蛋白。

    RIP

    已知蛋白,寻找RNA。

    RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation,RNA结合蛋白免疫沉淀)技术采用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经分离纯化对RNA进行分析。

    该技术用于寻找与目的蛋白结合的RNA。

    EMSA

    已知RNA,已知蛋白,判断是否结合。

    EMSA(Electrophoretic Mobility Shift Assay,凝胶迁移)技术是通过凝胶电泳迁移检测蛋白-RNA互作的一种技术。

    首先将设计好的带有标记的RNA探针与样本蛋白混合孵育,形成蛋白-RNA复合物。因复合物分子量大,会在聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁?#24179;下?#32780;没有结合蛋白的探针则较快。利用非变性聚丙烯酰胺凝胶分离,来确定RNA结合蛋白的特异性。

    该技术用于体外验证预测的RNA与蛋白之间是否能够结合。

    亚细胞定位研究

    亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位,例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。越来越多的证据显示,在生物学过?#35752;?#20301;于不同的亚细胞器RNA拥有不同的功能,亚细胞定位有利于更深入地了解RNA的生物功能。

    RNAFISH

    RNAFISH,即RNA的免疫荧光原位杂交,是将已标记的RNA探针(可在探针上标记荧光基团、生物素、地高辛等)与组织切片或细胞中的待测RNA中的互补序列杂交,从而对组织细胞中的RNA进行定性、定位和相对定量分析。

    数据库

    ?#20302;?#30340;告诉你,RNALocate数据库(http://www.rna-society.org/rnalocate)收录了超过42,000个人工收集的RNA的亚细胞定位信息,包含超过23,100个RNA,在65个物种中的42个亚细胞定位。lncATLAS数据库(http://lncatlas.crg.eu/)则是一个专门收录lncRNA亚细胞定位的数据库。有需要的可以先去查询!

    参考文献:

    Zhang T , Tan P , Wang L , et al. RNALocate: A resource for RNA subcellular localizations[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 45(Database issue).

    Mas-Ponte D, Carlevaro-Fita J, Palumbo E, Pulido TH, Guigo R, Johnson R. LncATLAS database for subcellular localization of long noncoding RNAs. Rna. 2017 Jul 1;23(7):1080-7.

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